Anticorpo Monoclonale Anti-Cas9 Coniglio per WB, IF/ICC, ELISA - Q99ZW2

Specifiche e Parametri Principali del Prodotto

Contesto Biologico: Funzione e Localizzazione di Cas9

• Cas9 (CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1) è una DNA endonucleasi guidata da RNA di 158.4 kDa che forma il nucleo enzimatico del sistema immunitario adattativo CRISPR-Cas di tipo II in Streptococcus pyogenes. Riferimenti correlati: PMID:21455174
• Nel suo ruolo biologico nativo, Cas9 protegge i batteri da plasmidi invasivi e DNA virale incorporando brevi sequenze estranee (spacer) nei loci CRISPR, fornendo una memoria genetica per l'immunità specifica di sequenza. Riferimenti correlati: PMID:21455174
• Cas9 richiede due piccoli RNA—un CRISPR RNA (crRNA) e un trans-activating crRNA (tracrRNA)—sia per il legame al DNA target che per l'attività nucleasica; è cataliticamente inattiva in assenza di queste RNA guida. Riferimenti correlati: PMID:24270795 PMID:24476820
• Il riconoscimento del target è governato da un breve motivo adiacente al protospacer (PAM; 5'-NGG-3') all'interno della ripetizione CRISPR, che serve a discriminare il DNA self dal non-self; il legame al PAM inizia la separazione del filamento di DNA e la formazione dell'eteroduplex. Riferimenti correlati: PMID:24476820
• Dopo il riconoscimento del PAM, Cas9 catalizza il taglio endonucleolitico del filamento target non complementare al crRNA, seguito da un trimming esonucleolitico 3'-5'; entrambi i passaggi nucleasici dipendono da ioni magnesio o manganese. Riferimenti correlati: PMID:24476820
• Nella maturazione dell'RNA CRISPR, Cas9 non catalizza il processamento; stabilizza il duplex pre-crRNA:tracrRNA, consentendo un taglio accurato da parte della ribonucleasi III dell'ospite. Riferimenti correlati: PMID:24270795

Guida Sperimentale e Consigli Tecnici

• L'immunogeno comprende gli amminoacidi 450-730 di Cas9, una regione che include il dominio nucleasico HNH e il dominio di interazione con il PAM. Per il western blot, considerare l'uso di lisati da cellule trasfettate con Cas9 o Cas9 ricombinante full-length purificata come controllo positivo; il peso molecolare previsto è 158 kDa.
• Nell'immunofluorescenza/ICC, la localizzazione di Cas9 può variare a seconda dell'RNA guida e del target. Validare le condizioni di fissazione e permeabilizzazione con controlli appropriati e confermare la specificità utilizzando linee cellulari knockout o knock-down per Cas9, se disponibili.
• Per l'ELISA, il frammento ricombinante di Cas9 può essere utilizzato per stabilire una curva standard; tuttavia, valutare la cross-reattività con Cas9 endogeno o altri membri della famiglia nella matrice biologica rilevante prima dell'applicazione quantitativa.
• Questo anticorpo è previsto avere un'ampia cross-reattività, incluso con Cas9 umano. Quando si utilizzano campioni di altre specie, si raccomanda una validazione iniziale per confermare la reattività attesa.

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