Anticorpo monoclonale di coniglio anti-MLKL per WB, IF/ICC, IHC-P, ELISA - Q8NB16

Specifiche e parametri principali del prodotto

Contesto biologico: funzione e localizzazione di MLKL

• MLKL è una pseudchinasi priva di attività intrinseca di protein-chinasi e agisce come effettore critico della morte cellulare necroptotica indotta dal TNF. Riferimenti correlati: PMID:22265413, PMID:22265414, PMID:22421439

• In seguito alla fosforilazione da parte di RIPK3, MLKL va incontro a omotrimerizzazione e si trasloca sulla membrana plasmatica, dove induce l'afflusso di calcio e la rottura della membrana plasmatica, caratteristiche distintive della necroptosi. Riferimenti correlati: PMID:22265413, PMID:22265414, PMID:22421439

• Oltre alla necroptosi citoplasmatica, MLKL può promuovere anche la necroptosi nucleare durante l'infezione da orthomyxovirus. ZBP1 rileva lo Z-RNA virale e attiva RIPK3 nel nucleo, portando alla fosforilazione di MLKL, alla destabilizzazione dell'involucro nucleare e alla fuoriuscita nel citosol del DNA (per similarità).

• Il legame di MLKL all'inositolo esakisfosfato (InsP6) è essenziale per la sua funzione necroptotica, collegando la segnalazione dei fosfoinositidi all'esecuzione della morte cellulare. Riferimenti correlati: PMID:29883610

• A livello subcellulare, MLKL risiede principalmente nel citoplasma, ma si trasferisce alla membrana cellulare e al nucleo in seguito all'attivazione, in linea con i suoi doppi ruoli nella destabilizzazione della membrana e dell'involucro nucleare.

• La proteina contiene un dominio coiled-coil N-terminale e un dominio pseudchinasico C-terminale, ed è soggetta a splicing alternativo, che genera isoforme in grado di regolare la necroptosi o con funzioni ancora sconosciute.

• Le modificazioni post-traduzionali, in particolare la fosforilazione mediata da RIPK3, sono fondamentali per l'attivazione, l'oligomerizzazione e il targeting di MLKL verso la membrana; altre modificazioni e interazioni possono modulare finemente la sua attività.

Indicazioni sperimentali e suggerimenti tecnici

• L'immunogeno utilizzato comprende gli amminoacidi 369-471 all'interno del dominio pseudchinasico C-terminale di MLKL umano (NP_689862.1). È probabile che questa regione riconosca sia la proteina a lunghezza intera sia le isoforme contenenti questo segmento; confermare la specificità nel proprio sistema modello mediante controlli RNAi o knockout.

• Per il Western blot, per MLKL umano è prevista una banda intorno a 54 kDa. La diluizione ottimale deve essere determinata empiricamente utilizzando lisati cellulari con necroptosi indotta (ad esempio, trattamento con TNF-alfa + mimetico di Smac + z-VAD-fmk) come controlli positivi.

• Le applicazioni IF/ICC e IHC-P possono richiedere un recupero antigenico e una permeabilizzazione ottimizzati in base al tipo di campione. Gli stimoli necroptotici possono arricchire MLKL presso la membrana plasmatica, fornendo un controllo dinamico della localizzazione.

• I protocolli ELISA possono essere sviluppati utilizzando la proteina MLKL ricombinante o lisati cellulari; per aumentare la sensibilità, è opportuno considerare coppie di anticorpi per ELISA sandwich.

• È stata segnalata reattività crociata con campioni umani e murini; tuttavia, si raccomanda la validazione nella specie e nel tessuto di interesse prima di studi su larga scala.

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