Anticorpo monoclonale anti-Mouse Ki67 () per Citometria a flusso (Intracellulare) - E9PVX6

Specifiche principali del prodotto e parametri

Contesto biologico: Funzione e localizzazione del Ki67

• Ki67, codificato dal gene Mki67, è una grande proteina marcatrice di proliferazione con un peso molecolare di ~351 kDa (350864 Da da UniProt) che si associa ai cromosomi mitotici. Agisce come un repellente cromosomico durante la mitosi precoce e come un attrattore cromosomico durante la mitosi tardiva, garantendo una corretta dispersione e aggregazione dei cromosomi (PubMed:27362226). Riferimenti correlati: PMID:27362226
• Durante la mitosi precoce, Ki67 si localizza nuovamente dai nucleoli alla superficie dei cromosomi, formando strutture estese simili a spazzole. Queste strutture forniscono una barriera sterica ed elettrostatica, agendo come un tensioattivo per prevenire il collasso dei cromosomi e consentire la motilità indipendente (PubMed:27362226). Riferimenti correlati: PMID:27362226
• In anafase, la defosforilazione di Ki67 e l'esposizione di una patch basica conservata innescano la separazione di fase liquido-liquido dipendente da RNA sulla superficie cromosomica, promuovendo l'aggregazione dei cromosomi e facilitando il riassemblaggio nucleare. Questa transizione di fase trasforma Ki67 da repellente ad attrattore.
• Ki67 si lega al DNA con una preferenza per il DNA superavvolto e ricco di AT, e si lega anche agli RNA ribosomiali immaturi durante l'anafase, contribuendo alla separazione di fase. Tuttavia, non contribuisce alla struttura interna dei cromosomi mitotici (PubMed:26949251). Riferimenti correlati: PMID:26949251
• A livello subcellulare, Ki67 si localizza nel nucleolo durante l'interfase e si transloca sulla superficie dei cromosomi durante la mitosi. È espresso prevalentemente nelle cellule proliferanti, fungendo da marcatore affidabile dell'attivazione del ciclo cellulare.
• Le modifiche post-traduzionali includono acetilazione, fosforilazione e ubiquitinazione, che regolano le sue funzioni mitotiche e la localizzazione dinamica.

Guida sperimentale e suggerimenti tecnici

• Per la citometria a flusso intracellulare, utilizzare un metodo di permeabilizzazione compatibile con gli antigeni nucleari, come il metanolo o tamponi a base di saponina, per garantire l'accesso dell'anticorpo al Ki67 nel nucleolo e sui cromosomi.
• Titolare l'anticorpo tra 0,1–1 µg per 10^6 cellule per determinare la concentrazione di colorazione ottimale per il tipo di cellula specifico e il protocollo.
• Includere un controllo positivo, come linee cellulari murine in proliferazione (es. NIH/3T3, CTLL-2) o linfociti primari stimolati, e un controllo negativo (es. controllo isotipico o cellule a riposo) per validare la specificità della colorazione.
• Fissare le cellule prontamente per preservare la distribuzione del Ki67; la conservazione prolungata può influenzare l'integrità dell'epitopo. La fissazione con paraformaldeide seguita dalla permeabilizzazione è comunemente utilizzata.
• Il coniugato è compatibile con la rilevazione standard tramite laser rosso (633–647 nm); assicurare set di filtri appropriati e una compensazione minima se si esegue multiplexing.

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