Anticorpo policlonale coniglio anti-Fosfo-NF-kB p65/RelA-S536 per WB, IF/ICC, ELISA - Q04206

Specifiche e parametri principali del prodotto

Contesto biologico: Funzione e localizzazione del fattore di trascrizione p65

• La subunità p65 di NF-kappa-B (RELA) è un fattore di trascrizione centrale della famiglia NF-kappa-B, codifica una proteina di 60 kDa (nota anche come p65, NFKB3, CMCU, AIF3BL3) con ruoli critici nelle risposte immunitarie e allo stress. Voce UniProt Q04206.
• Il complesso NF-kappa-B esiste come omodimero o eterodimero; l'eterodimero RELA-NFKB1 (p50) è il più abbondante e funziona come attivatore trascrizionale legandosi a specifici motivi di DNA κB nei promotori genici.
• L'attivazione di NF-kappa-B comporta la fosforilazione indotta da stimolo e la degradazione degli inibitori IκB, liberando il complesso RELA che si trasloca dal citoplasma al nucleo. La fosforilazione di RELA alla Serina 536, situata nel dominio di transattivazione, aumenta la sua attività trascrizionale e rappresenta un segno distintivo dell'attivazione canonica di NF-κB.
• La localizzazione subcellulare di RELA è strettamente controllata: nelle cellule a riposo è prevalentemente citoplasmatico e legato a IκB; dopo l'induzione si accumula nel nucleo per modulare l'espressione genica bersaglio. L'immunofluorescenza permette di rilevare la traslocazione nucleare come indicatore dell'attivazione della via.
• RELA è soggetta a numerose modifiche: fosforilazione, acetilazione, metilazione, S-nitrosilazione e ubiquitinazione, che regolano finemente la sua attività trascrizionale. È essenziale per l'espressione di citochine nelle cellule T (PubMed:15790681) e per la risposta interferon di tipo I durante l'infezione da SARS-CoV-2 (PubMed:33440148). Riferimenti correlati: PMID:15790681 PMID:33440148
• Il gene RELA codifica per più isoforme e la sua attività è modulata tramite interazioni con cofattori e rimodellatori della cromatina, evidenziando complessi livelli di regolazione che vanno al di là della semplice entrata nel nucleo.

Indicazioni sperimentali e consigli tecnici

• Preparare lisati di cellule o tessuti con miscele di inibitori di proteasi e fosfatasi per preservare la fosforilazione alla Ser536. Per il Western blotting, separare le proteine tramite SDS-PAGE e incubare con questo anticorpo a una diluizione iniziale verificata dall'utente finale; è attesa una banda intensa vicino a 60 kDa.
• Per l'immunofluorescenza o l'immunocitochimica (IF/ICC), fissare le cellule con paraformaldeide al 4% e permeabilizzare adeguatamente; utilizzare un tampone di blocco appropriato per minimizzare il legame non specifico. Analizzare la traslocazione nucleare di NF-kB p65 in condizioni di stimolo infiammatorio (ad es. trattamento con TNF-α) per convalidare il segnale fosfo-specifico.
• Nelle applicazioni ELISA, considerare l'uso di un controllo di blocco con peptide fosforilato per confermare la rilevazione specifica della forma fosforilata. Titrare l'anticorpo per determinare le concentrazioni ottimali nel contesto specifico del tuo saggio.
• La dinamica della fosforilazione può variare tra i diversi tipi cellulari; includere sempre controlli positivi e negativi (ad es. cellule stimolate vs non stimolate) per interpretare i risultati in modo accurato.

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