Anticorpo policlonale di coniglio DiMethyl-Histone H3-K4 (Q16695/P68431) per WB, ChIP, ChIP-seq, IHC-P

Specifiche e parametri principali del prodotto

Contesto biologico: Funzione e localizzazione di Istona H3.1t/Istona H3.1

L'istone H3 è un componente centrale del nucleosoma, l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina. Insieme agli istoni H2A, H2B e H4 forma un ottamero attorno al quale sono avvolti 147 paia di basi di DNA, compattando il genoma e regolando l'accessibilità al DNA. Questa struttura è essenziale per i processi basati sul modello DNA, tra cui la trascrizione, la replicazione, la riparazione e la stabilità cromosomica.

La variante canonica dell'istone H3.1 è codificata da più geni (ad esempio da HIST1H3A a HIST1H3J) e viene depositata sul DNA appena replicato durante la fase S. Al contrario, l'isoforma H3.1t (gene H3-4 / HIST3H3) è una variante specifica del testicolo, espressa principalmente nelle cellule testicolari e potenzialmente coinvolta nel rimodellamento della cromatina durante la spermatogenesi.

L'istone H3 subisce estese modifiche post-traduzionali (PTM) sulla sua coda N-terminale flessibile, formando un complesso "codice istonico" regolatorio. Tra le PTM note figurano metilazione, acetilazione, fosforilazione, ADP-ribosilazione, ubiquitinazione e altre. La metilazione della lisina 4 (H3K4) è un marcatore chiave: la dimetilazione (H3K4me2) è associata a elementi regolatori genici attivi e pronti all'attivazione come promotori e enhancer.

Questo anticorpo è stato sviluppato contro un peptide sintetico corrispondente alla coda N-terminale (amminoacidi 1-100) dell'istone H3 umano, una regione che include il residuo K4 ed è altamente conservata tra le specie. L'anticorpo riconosce specificamente la forma dimetilata di K4.

L'istone H3 si localizza nel nucleo ed è un componente strutturale dei cromosomi.

Riferimenti correlati: PMID:16267050, PMID:17194708, PMID:24681537

Indicazioni sperimentali e consigli tecnici

• L'immunogeno comprende la coda N-terminale dell'istone H3, garantendo il riconoscimento della regione contenente il residuo K4. Per la rilevazione specifica della metilazione, eseguire la validazione con appropriati saggi di blocco peptidico o controlli di istone mutante.
• Per il Western blotting (WB) è possibile utilizzare estratti arricchiti in istoni o lisati cellulari totali. La banda attesa è di circa 15 kDa. Per ridurre al minimo il fondo, si consiglia di utilizzare una membrana di trasferimento di alta qualità e un blocco prolungato.
• Nell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e nel ChIP-seq, questo anticorpo può essere adatto per mappare la distribuzione di H3K4me2. Includere loci di controllo positivo (ad esempio promotori attivi) e loci di controllo negativo (ad esempio regioni intergeniche) per valutare la specificità. Durante l'esecuzione del ChIP-seq, la preparazione delle librerie e la profondità di sequenziamento devono essere ottimizzate in base al disegno sperimentale specifico.
• Per l'immunistochimica (IHC-P) e l'immunofluorescenza (IF/ICC), il recupero dell'antigene (ad esempio con buffer citrato a pH 6.0 mediato dal calore) e la permeabilizzazione possono migliorare la rilevazione. Provare diversi metodi di fissazione (ad esempio formalina contro metanolo) poiché possono influenzare la disponibilità dell'epitopo.
• L'anticorpo mostra una reattività crociata prevista con uomo, topo, ratto e altre specie grazie all'elevata conservazione della sequenza dell'N-termino di H3. Se si utilizza una specie nuova, si consiglia di eseguire un allineamento di sequenza per confermare la conservazione dell'epitopo e realizzare un esperimento di controllo positivo.
• Gli anticorpi specifici per la metilazione possono mostrare reattività crociata con altri marcati di metil-lisina. Per confermare la specificità, includere esperimenti competitivi di blocco peptidico utilizzando dimetil-K4 e altri peptidi modificati.
• Le diluizioni ottimali devono essere determinate empiricamente per ogni saggio.

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