[Convalidato KO] Anticorpo Monoclonale Coniglio Anti-Caspase-8 per WB, ELISA - Q14790

Specifiche e Parametri Principali del Prodotto

Contesto Biologico: Funzione e Localizzazione della Caspase-8

• La Caspase-8 (anche designata FLICE, MACH, MCH5) è una caspasi iniziatrice di 55 kDa della famiglia delle proteasi cisteina-aspartico, prodotta in multiple isoforme attraverso splicing alternativo; l'isoforma 1 a lunghezza intera è cataliticamente attiva mentre le isoforme più corte possono agire come inibitori dominanti-negativi.
• Come iniziatore chiave dell'apoptosi estrinseca, la Caspase-8 viene reclutata tramite l'adattatore FADD ai complessi dei recettori di morte (DISC) dopo stimolazione di FAS o TNFRSF1A, portando alla sua dimerizzazione, clivaggio autocatalitico e successiva attivazione delle caspasi effettrici a valle (CASP3/7) e BID per eseguire la morte cellulare. Riferimenti correlati: PMID:8681376, PMID:8681377, PMID:9184224
• Oltre all'apoptosi, la Caspase-8 regola negativamente la necroptosi clivando RIPK1 ad Asp-324, il che inibisce l'attività chinasi di RIPK1 e previene la segnalazione necroptica e infiammatoria indotta da TNF. Riferimenti correlati: PMID:31827280, PMID:31827281
• La Caspase-8 media anche la piroptosi clivando e attivando gasdermina-C (GSDMC) e gasdermina-D (GSDMD), rilasciando i loro domini N-terminali di formazione dei pori che causano rottura della membrana e morte cellulare infiammatoria. Riferimenti correlati: PMID:32929201, PMID:34012073
• Si localizza prevalentemente nel citoplasma ma può essere trovata nel nucleo e ai lamellipodi; la fosforilazione a Tyr-380, indipendente dalla sua attività proteolitica, promuove la migrazione cellulare. Riferimenti correlati: PMID:18216014, PMID:27109099
• La Caspase-8 è ampiamente espressa, con i livelli di mRNA più alti nei leucociti del sangue periferico, milza, timo e fegato, e un'espressione molto bassa nel cervello, testicolo e muscolo scheletrico.
• Inoltre, la Caspase-8 cliva PARP1 e PARP2 durante l'apoptosi e può partecipare alle vie di morte cellulare citotossica mediate dalla Granzima B. Riferimenti correlati: PMID:8681376, PMID:8755496

Guida Sperimentale e Consigli Tecnici

• L'immunogeno corrisponde ai residui 200-300 all'interno del dominio catalitico della Caspase-8 umana; questa regione è presente nel proenzima a lunghezza intera e nella grande subunità catalitica, quindi l'anticorpo può rilevare sia le forme non elaborate che quelle clivate.
• Per il Western blot, eseguire SDS-PAGE in condizioni riducenti; prevedere una banda principale a ~55 kDa (lunghezza intera) e, a seconda del trattamento cellulare, bande più piccole che rappresentano i frammenti attivi p18/p10. Includere sempre marcatori di peso molecolare.
• Questo anticorpo è riportato come convalidato KO; considerare l'uso di lisati cellulari con knockout di Caspase-8 come controllo negativo per confermare la specificità della banda nel proprio sistema sperimentale.
• Per le applicazioni ELISA, eseguire una titolazione a scacchiera per stabilire le concentrazioni ottimali dell'antigene di rivestimento e dell'anticorpo; convalidare rispetto a uno standard noto se disponibile.
• Quando si studia l'attivazione della Caspase-8, trattare le cellule con induttori appropriati (es. TNF-α + cicloesimide per l'apoptosi, o TNF-α + zVAD + mimetico Smac per la necroptosi) e monitorare la cinetica di clivaggio per distinguere tra le modalità di morte.
• La reattività incrociata è riportata solo per l'umano; se si applica ad altre specie, allineare la sequenza peptidica immunogenica con la Caspase-8 dell'organismo bersaglio per valutare la potenziale reattività.

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